舒韵1,2,闫茂成1,,魏英华1,刘福春1,韩恩厚1,柯伟1

1 中国科学院金属研究所 沈阳 110016
2 中国科学技术大学材料科学与工程学院 沈阳 110016

摘要

关键词：微生物腐蚀;管线钢;微区电化学技术;生物膜;硫酸盐还原菌

微生物导致的腐蚀(MIC)在材料腐蚀失效中占重要比例。硫酸盐还原菌(SRB)广泛存在于土壤、海水及河水等自然环境中,是影响管道、油气井等地下金属设施MIC的主要厌氧菌[1,2]。一般认为SRB的呼吸过程为硫酸盐呼吸,SRB以SO42-为电子受体氧化有机物,利用分子氢、脂肪酸、脂肪烃等有机物作为碳源和电子供体维持其生命所必需的能量[3],通过分泌胞外聚合物(EPS)形成生物膜黏附于金属表面,加速材料的腐蚀。据报道,含SRB环境中碳钢的点蚀速率高达0.7~7.4 mm/a[4]。

自1910年Gaines[5]首次报道MIC现象以来,人们对SRB环境中金属材料的腐蚀行为进行了大量研究[6,7,8,9,10,11],但由于微生物过程的复杂性,对SRB的腐蚀机制仍不明确,目前广泛接受的机理主要有阴极去极化理论[12]、浓差电池理论[13]、代谢产物理论[14,15]、阳极加速理论[16,17]和近年来提出的直接电子转移理论[18,19,20,21,22]。近几年来,SRB腐蚀研究主要集中于有机酸、H2S、FeS等代谢产物作用,生物膜作用,以及SRB细胞与Fe间的直接电子作用等。Jia等[23]提出胞外电子转移方式主导SRB腐蚀过程。作者研究组的结果[24]表明,在SO42-匮乏环境中,SRB可调整呼吸代谢方式,转而利用Fe(III)、Mn(IV)及H2等作为末端电子受体[25],进行胞外呼吸,维持生存代谢,促进碳钢腐蚀的过程。尽管如此,目前人们对影响MIC过程的生物膜及其与膜下金属交互作用等的认识仍然非常有限。

生物膜是细菌在自然环境中的主要生存方式,其对菌群形态、MIC行为等均有至关重要的影响。生物膜构建了微生物于恶劣环境中生存的一种保护模式,研究[26]表明,生物膜中细菌与浮游细胞的基因表达显著不同;同时,生物膜与腐蚀产物Fe2+/Fe3+存在络合、螯合作用,与金属间存在直接或间接电子交互作用,但这些交互作用的具体过程和途径尚不清晰。通过这些作用,微生物影响和改变了膜下金属的腐蚀行为和电化学过程。

本工作针对海水中管线钢的MIC过程,采用扫描电镜(SEM)、X 射线光电子能谱(XPS)、扫描振动电极(SVET)、Raman光谱等表面形貌分析技术,结合极化扫描和电化学阻抗谱(EIS)等电化学测量技术,通过生物膜特征及金属-介质-微生物膜间界面一些现象的表征,研究管线钢在存在SRB的热带海水环境中的腐蚀行为,探讨海水环境中SRB生物膜与X80钢间的交互作用,及其对管线钢腐蚀行为的影响。

1 实验方法

1.1 实验材料及介质

实验用X80钢的化学成分(质量分数,%)为: C 0.07,Mn 1.82,Si 0.19,P 0.007,S 0.023,Mo 0.23,Ni 0.17,Cr 0.026,Cu 0.020,V 0.002,Nb 0.056,Ti 0.012,Al 0.028,N 0.004,B 0.0001,Fe余量。电化学测量试样的工作面积为10 mm×10 mm,厚度小于3 mm。试样背面连接Cu导线,用环氧树脂密封非工作面及导线连接处。水磨砂纸逐级打磨工作面至1000号,用去离子水冲洗及酒精清洗,吹干,存于干燥皿中备用。用于SVET测试的样品预先镶嵌在特制环氧树脂中,打磨清洗吹干。

SRB取自渤海海泥,采用修正的Postage's C培养基对SRB进行富集培养。培养基的成分：每升溶液含0.5 g KH2PO4,1 g NH4Cl,0.06 g CaCl2 ?6H2O,0.06 g MgSO4 ?7H2O,6 mL 70% C3H5O3Na,1 g酵母汁,0.3 g C6H5Na3O7,0.06 g/L (NH4)2Fe(SO4)2。由NaOH溶液调pH值至7.0~7.2之间,通N2除氧及高压灭菌锅灭菌后,密封备用。SRB菌液于4 ℃下保存;实验前在30 ℃下活化12 h。

实验采用通N2除氧并灭菌处理的3.5%海水晶溶液。将富集培养并经活化后的SRB菌种按5%体积比加入到3.5%海水晶溶液中;灭菌对照组实验将灭菌培养基按5%体积比加入到3.5%海水晶溶液中。实验前实验体系中所用溶液、容器、电极等均经高压灭菌锅或紫外灯照射灭菌处理,避免杂菌污染。

1.2 实验方法

为研究X80钢表面SRB生物膜的形成过程及其对钢基体腐蚀的影响,进行周期为1、3、7和14 d的接菌浸泡实验。实验过程中,定时抽取溶液约1 mL,采用最大可能计数法(MPN)进行细菌计数。所有浸泡实验均在30 ℃恒温水浴锅中进行。

开路电位(EOCP)及EIS等电化学测试在PARSTAT 2273电化学工作站上进行。测试采用三电极系统：工作电极为X80钢,辅助电极为大面积Pt片,参比电极为饱和甘汞电极(SCE)。线性极化的扫描范围为EOCP±20 mV,扫描速率为0.166 mV/s。EIS激励信号为10 mV的正弦波,频率范围10-2~105Hz,测量结果用ZSimpWin软件进行拟合。

为研究SRB生物膜与钢基体间的电化学交互作用,在生物膜局部划伤处进行SVET微区电化学测试。接菌浸泡14 d后取出试样,用美工刀在试样表面生物膜划一长1 mm的划痕,露出基体金属,在划伤处进行SVET测试。测试采用Model 200型SVET系统,控制软件为ASET 2.0。振动微电极是尖端镀Pt的Pt/Ir合金丝。在SVET测试过程中,探针尖端距离样品表面100 μm,扫描区域为3 mm×3 mm。SVET可以判断出样品表面上方溶液中电流为阳极电流还是阴极电流。

对用于生物膜形貌观察的接菌试样进行微生物固定及脱水处理[27]：用含3%戊二醛的磷酸缓冲盐溶液固化0.5 h后,依次用PBS溶液和去离子水清洗2次,每次清洗5 min,然后再用50%、75%、95%和99%的酒精进行逐级脱水处理,每次10 min。脱水结束迅速吹干。用于表面元素分析的试样进行酒精清洗、吹干即可。为观察生物膜下试样腐蚀形貌,将试样在500 mL盐酸+500 mL H2O+3.5 g六次甲基四胺中进行除锈处理。

采用XL30-FEG型SEM观察试样表面腐蚀形貌,由其自带的能谱(EDS)分析腐蚀产物成分。采用SO-TN04显微共聚焦Raman光谱仪分析腐蚀产物。采用ESCALAB 250型XPS确定腐蚀产物中S的化学状态。高清S轨道谱在50 eV下获取,通过标准C谱校准。

2 实验结果和讨论

2.1 SRB生物膜及腐蚀产物形貌

计数结果表明,SRB接菌海水中悬浮细菌数量随时间的变化呈先升高后降低的趋势。模拟海水的pH值在8左右,适宜SRB生长,因此起始阶段SRB细菌数量呈指数上升,第5 d达到最大值,约2×108cfu/mL。之后由于营养物质的消耗殆尽,细菌数量逐渐下降,到14 d时细菌数量降到了9.5×104cfu/mL左右。

图1为接菌海水中浸泡3、7和14 d后的X80钢表面SRB生物膜及截面的SEM像。由图可见,浸泡3 d后有些许絮状腐蚀产物分布在试样表面,疏松而不连续(图1a)。由高倍SEM像可发现腐蚀产物同细菌一起黏附在EPS上,构成生物膜(图1b)。白色絮状物多为腐蚀产物,EDS显示此处O含量高。随浸泡时间延长,试样表面腐蚀产物、细菌及EPS逐渐增多,7 d后呈团簇状吸附聚集在试样表面,但生物膜分布尚不连续(图1d和e)。14 d后试样表面可看到包裹着细菌和腐蚀产物的连续生物膜(图1g和h)。有研究[28]表明,生物膜内细菌密度较悬浮状态高出5~6个数量级。此过程中,生物膜从疏松到连续,其吸附作用源于相邻细菌间的相互协同作用[29,30]。EPS可通过Van der Waals力、离子键、氢键吸附多种胶体颗粒,达到“架桥”作用,聚集微生物并引起细胞界面更大的吸附[31]。试样表面生物膜的形成及其结构变化,导致基体表面电化学性质的不均匀性,为局部腐蚀的发生创造条件[28]。

图1接菌海水中浸泡3、7和14 d后X80钢表面的SRB生物膜及截面SEM像

Fig.1Low (a, d, g) and high (b, e, h) magnified surface SEM images and cross section SEM images (c, f, i) of SRB biofilm of X80 steel after 3 d (a~c), 7 d (d~f) and 14 d (g~i) exposed in inoculated seawater (SRB—sulfate-reducing bacteria, EPS—extracellular polymeric substance)

由截面可见,生物膜厚度随时间的延长而增加(图1c、f和i),膜的结构发生变化,EDS显示S含量也随时间延长而增多。由14 d后截面图可观察到,生物膜中腐蚀产物与EPS等交织在一起,较疏松的白色腐蚀产物膜由表面向膜下延伸,说明生物膜对产物Fe2+有吸附作用。这层疏松多孔膜中的FeS使金属表面粗糙度增加,有利于细菌的附着及生物膜的形成[32]。

2.2 生物膜及腐蚀产物元素分析

接菌海水中试样表面SRB生物膜/腐蚀产物的元素面扫描结果如图2所示。由图可见,X80钢表面SRB生物膜主要由C、O、S、Fe等元素构成,其中,C、O、S等元素明显富集,而Fe含量较基体明显降低。S主要集中于SRB生物膜及其EPS上。实际上,细菌EPS一般包括多糖、蛋白质、核酸、脂质、磷脂和腐殖质等组分,其对生物膜内微生物有保护作用,可避免不利条件的影响。C及O大多集中在腐蚀产物(如Fe的氧化物)上,代谢产物如胞外聚合物上也有少量分布。生物膜与金属存在相互作用,腐蚀产物也会存在于生物膜内,环境中的一些无机沉淀物(如沉积物或垢沉积)也是生物膜的一部分。

图2接菌海水中X80钢上生物膜的SEM像及元素面分布图

Fig.2SEM image and distributions of elements on biofilm of X80 steel in inoculated seawater

图3为X80钢在接菌海水中及灭菌海水(对照组)浸泡14 d后腐蚀产物的Raman光谱。2种环境中在550 cm-1附近都出现了Raman峰,说明都有Fe3O4的产生,Fe3O4有较好的致密性和稳定性,是电导体,可参与还原反应。接菌环境中试样在208和282 cm-1出现Raman峰,且随时间推移强度升高,峰位向右轻微偏移。208 cm-1对应FeS特征谱线,属点阵模型。282 cm-1处光谱峰是结构无序峰,属于非晶体硫化亚铁微晶中Fe-S键不对称伸缩振动模型,与文献[33]报道FeS的Raman谱一致。此外,380 cm-1处Raman峰的出现对应γ-FeOOH的特征峰,说明γ-FeOOH等腐蚀产物的产生。接菌3 d时可检测到FeSO4峰的存在,而后期该峰消失,说明SO42-浓度减少。

图3灭菌及接菌海水中浸泡后X80钢腐蚀产物的Raman光谱

Fig.3Raman spectra of the corrosion production of X80 steel after 14 d exposed in the sterile and SRB inoculated seawater

图4分别为接菌环境中浸泡1、7和14 d的样品表面S的XPS精细谱。结合能较高的轨道峰对应于S的氧化态,结合能较低的轨道峰对应于S的还原态[34]。由拟合结果可知,随时间延长,S谱峰值向低结合能方向移动,根据文献[35,36,37,38,39,40,41]确定S的化合价态,对应硫化物示于图中。S元素化合价由+6价向-2价偏移,硫酸盐或亚硫酸盐被SRB还原为低价硫化物。且低价S轨道峰随时间延长而增加,尤其第7 d后更为明显,与菌数量变化相对应,说明接菌条件下SRB的生理活动导致S化合价态降低。精细谱拟合结果中,化合物子峰对应的面积与其含量正相关,通过归一化处理定量分析,各硫化合物占比列于表1。如表1所示,实验初期S主要存在于SO42-中,随着时间的延长而增加,SO42-逐渐转化为S2-,浸泡7和14 d后S2-的占比分别为30.48%和37.89%。

图4接菌环境中浸泡1、7和14 d后样品表面腐蚀产物中S的XPS精细谱

Fig.4S spectra of X80 steel after 1 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in the SRB inoculated seawater

浸泡3、7和14 d后SRB生物膜下试样表面的腐蚀形貌示于图5。可见,实验3 d后试样表面腐蚀轻微(图5a),随着浸泡时间的延长,开始出现明显的局部腐蚀(图5b)。有研究表明,低浓度的EPS在碳钢表面吸附成膜抑制阴极反应过程,抑制碳钢的腐蚀[42];高浓度的EPS对Fe2+具有络合作用,能够促进基体材料的阳极溶解[43]。实验14 d时,出现一些较大的点蚀坑,整个表面出现大量的微小腐蚀坑(图5c)。这说明连续完整的生物膜对均匀腐蚀有减缓作用,但促进了局部腐蚀的发生和发展,这是EPS及生物膜的屏障作用,不均匀分布[44],及其络合Fe2+/Fe3+等综合作用的结果。

图5接菌海水中浸泡3、7和14 d 后SRB生物膜下X80钢的腐蚀形貌

Fig.5Corrosion morphologies of X80 steel beneath SRB biofilm after 3 d (a), 7 d (b) and 14 d (c) exposed in inoculated seawater

2.3 SVET测试

X80钢表面SRB生物膜划痕破损处微区SVET电流密度分布如图6所示。SRB生物膜破损处基体为阳极区,阳极电流密度最高达36 μA/cm2;而划痕周围生物膜为阴极区,测试范围内最大阴极电流密度为36 μA/cm2。SVET电流分布说明该MIC腐蚀体系中,生物膜与钢基材间存在局部电化学耦合作用。这种局部耦合作用可能源于生物膜对Fe2+/Fe3+存在络合/螯合作用[43],与金属间存在直接或间接电子交互作用,促进基体的局部腐蚀。

图6接菌海水中浸泡14 d后X80钢表面SRB生物膜划伤处的SVET电流分布图(电流密度(i)正值为阳极区,负值为阴极区)

Fig.6SVET images of X80 steel on a scratch of SRB biofilm after 14 d exposed in inoculated seawater (The current density (i) is positive value in the anode region, whereas it is negative in the cathode region)

2.4 开路电位

图7为X80钢在灭菌和接菌海水中的EOCP随浸泡时间的变化。灭菌海水中EOCP初始为-720 mV左右,1 d后下降到-735 mV左右,保持2 d后开始上升,恢复到-720 mV左右,这可能由于腐蚀产物积聚所致。接菌海水中,EOCP从初始的-730 mV降低到-738 mV,保持几天后最终下降至-750 mV左右。可见,2种条件下的EOCP差异从第5 d开始变大,从第7 d开始EOCP保持恒定,且差异保持在30 mV左右,此时接菌试样EOCP的变化与菌数量变化规律呈对应关系,这体现了SRB生物膜的电活性特征[7,19]。随着浸泡时间的延长,腐蚀产物和代谢产物不断积累,导电性增强,促进钢表面电子转移,导致EOCP降低。

图7灭菌和接菌海水中X80钢开路电位随时间的变化

Fig.7Open circuit potential (EOCP) of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater as a function of time

2.5 电化学阻抗谱及极化电阻

图8为灭菌和接菌海水中X80钢的EIS结果。由Nyquist图可见,由于培养基和腐蚀产物影响,灭菌海水中EIS从第3 d起阻抗弧半径大幅增加(图8a)。随容抗弧增大,Bode图中低频阻抗模值|Z|0.01 Hz增大,最大相位角对应频率减小(图8c),Bode曲线向低频移动,这与逐渐增多的腐蚀产物膜有关。Bode图中|Z|0.01 Hz与Faraday过程相关,其绝对值与腐蚀速率呈负相关。

图8灭菌海水和接菌海水中X80钢的Nyquist和Bode图

Fig.8Nyquist (a, b) and Bode (c, d) plots of X80 steel in the sterile seawater (a, c) and inoculated (b, d) seawater

由接菌海水中的Nyquist及Bode图(图8b和d)可见,前3 d阻抗大于灭菌条件,但3 d后低于灭菌海水中阻抗。第7 d起阻抗降低,反映了SRB对X80钢腐蚀过程的促进作用。接菌的Bode图中相位角峰值对应频率不断向低频移动,移动范围大于灭菌环境,一般认为这种相位角移动是试样表面出现腐蚀的表现[45]。说明接菌海水中金属与混合膜界面发生变化,SRB在浸泡实验前期对腐蚀起抑制作用,后期却促进腐蚀。

一般而言,EIS中的低频电阻与Faraday反应过程有关,高频电阻与溶液电阻有关。前者反映出钢的腐蚀反应,后者代表了电解质的溶液电阻。故低频阻抗模值可用于表征腐蚀过程的电化学动力学参数。本工作中,极化电阻Rp由下式获得：

${?}_{\mathrm{p}}=|?{|}_{0.01\mathrm{Hz}}-|?{|}_{10\mathrm{kHz}}$(1)

式中,|Z|0.01 Hz和|Z|10 kHz分别为0.01 Hz和10 kHz处的阻抗模。由Stern方程[46]icorr=B×Rp-1(其中,icorr为腐蚀电流密度,B为常数)可见,Rp与腐蚀速率负相关,Rp-1可反映腐蚀速率的变化趋势。

图9为实验过程中X80钢的Rp随时间的变化规律。可以看出,实验初期,灭菌海水中X80钢的Rp随时间快速升高,至第3 d达到稳定。接菌海水中,实验前4 dRp基本稳定,第5 d开始下降。实验前3 d,接菌海水中Rp高于灭菌条件,即腐蚀速率低于灭菌条件;而3 d后,接菌海水中腐蚀速率高于灭菌条件;且浸泡实验后期,接菌海水中的腐蚀速率约为灭菌海水中的10倍(Rp低约1个数量级)。各阶段Rp、SRB数量及EOCP的变化呈对应关系,说明SRB达一定数量后其代谢产物、胞外聚合物等对试样腐蚀速率起到促进作用。

图9灭菌和接菌海水中X80钢极化电阻(Rp)随时间的变化

Fig.9Polarization resistance (Rp)vstime of X80 steel in the sterile and SRB inoculated seawater

2.6 分析讨论

生物膜是细菌在自然环境中的主要生存方式。微生物群落在水环境中通过浸润表面、细胞生长、复制、吸附、微菌落形成和EPS发展等过程形成生物膜。图10给出了海水中生物膜形成及X80钢的腐蚀过程示意图。实验初期(图10a)细菌主要以浮游态存在于溶液中,数量较少,但其逐渐吸附于钢表面形成微生物菌落并生成EPS,EPS基质对腐蚀离子起一定阻隔作用;同时,EPS有电负性特征,能排斥侵蚀性负离子,抑制X80钢的腐蚀。随着细菌快速增殖,产生大量EPS,形成不均匀的生物膜(图10b)。细菌的直接电子作用[20]和不均匀分布的生物膜引起浓差电池都可诱发和促进局部腐蚀。同时S2-与Fe2+反应生成FeS附着在基体表面,可与基体形成局部腐蚀电池,诱发点蚀坑的生成[34]。浸泡后期(图10c),SRB代谢产物与腐蚀产物沉积在钢表面,微生物菌落相互连接成完整生物膜,对均匀腐蚀过程有一定的抑制作用。但生物膜疏松多孔,其包裹的菌及大量的FeS,增加其导电性的同时还促进点蚀的发展,生物膜下酸量的增加也促进腐蚀。SVET结果也显示,生物膜参与阴极过程,从而促进基体腐蚀的发展。

图10含SRB海水中管线钢表面生物膜形成及膜下MIC腐蚀过程示意图

Fig.10Schematics of biofilm formation and corrosion process at the early stage (a), middle stage (b) and final stage (c) of X80 steel in SRB inoculated seawater

3 结论

(1) X80钢在含SRB海水浸泡过程中,SRB细胞附着期及生物膜形成初期,EPS的屏障作用抑制X80钢的腐蚀过程;但后期SRB的呼吸代谢活动导致X80钢的自然腐蚀电位降低约20 mV,并显著促进了管线钢的局部腐蚀过程。

(2) 由EIS测试结果推测,含SRB海水中浸泡后期X80钢的腐蚀速率较灭菌对照组高约1个数量级。SRB及其生物膜的作用致使X80管线钢发生严重点蚀。

(3) 海水中SRB代谢过程促进S从SO42-向S2-转变,并以FeS的形式在生物膜中沉积。生物膜作为阴极覆盖在试样表面,其与腐蚀产物间的络合、螯合作用,细胞及其代谢产物、生物膜与金属间存在直接或间接电子交互作用,这些作用相互协同耦合,促使生物膜下局部腐蚀的发生和发展。

来源--金属学报